La chromatographie est la technique de séparation la plus puissante et la plus utilisée en biologie. Ce chapitre en donne la définition, la classification par phase mobile et par mécanisme, puis les grandeurs qui décrivent un chromatogramme : temps de rétention, facteur de rétention, sélectivité, nombre de plateaux et résolution. Ces formules font l'objet d'exercices chiffrés chaque session.
1. Définition et repères historiques
La chromatographie est une méthode physique de séparation fondée sur la différence d'affinité des constituants d'un mélange pour deux phases : une phase stationnaire (solide ou liquide fixé sur un solide) et une phase mobile (liquide, gaz ou fluide supercritique) qui entraîne l'échantillon à travers la première. Chaque soluté subit une force de rétention (adsorption, solubilité, échange, tamisage) et une force d'entraînement ; la succession d'équilibres entre les deux phases aboutit à une migration différentielle : le composé le plus retenu sort en dernier. Le nom vient de Tswett, qui sépara en 1903 les pigments végétaux sur une colonne de craie. Martin et Synge, inventeurs de la chromatographie de partage, reçurent le prix Nobel de chimie en 1952 ; la chromatographie liquide instrumentale (HPLC) date des années 1960.
2. Classification des chromatographies
Selon la phase mobile, on distingue la chromatographie en phase liquide (CPL, dont l'HPLC), en phase gazeuse (CPG ou GC, pour les composés volatils) et en fluide supercritique (CFS). Selon le support, la chromatographie est planaire (papier, couche mince) ou sur colonne. Selon le mécanisme de rétention, on parle de chromatographie d'adsorption (critère : polarité, phase stationnaire solide), de partage (solubilité entre deux liquides, phase liquide fixée ou greffée), d'échange d'ions (charge), d'exclusion ou gel filtration (taille) et d'affinité (reconnaissance biospécifique). Il est rare qu'une séparation relève d'un seul mécanisme. Selon la quantité traitée, on analyse moins d'un milligramme (CCM, HPLC, CPG) ou l'on purifie de quelques dizaines de milligrammes à plusieurs grammes (colonne éclair, HPLC préparative) ; le dosage se fait par étalon interne ou courbe d'étalonnage.
3. Chromatographie d'adsorption, polarité et CCM
En adsorption, la phase stationnaire est un solide polaire : gel de silice (le plus courant), alumine, cellulose, charbon actif. Plus un composé est polaire, plus il est adsorbé et moins il migre ; l'ordre de polarité croissante des fonctions va des alcanes aux halogénures, éthers, esters, cétones, amines, alcools et acides, les composés chargés ne migrant pratiquement pas sur silice. La phase mobile liquide est l'éluant, dont on ajuste la force par mélange de solvants selon la série éluotrope (polarité croissante : hexane, tétrachlorométhane, toluène, éther, dichlorométhane, acétate d'éthyle, acétone, éthanol, méthanol, eau, acide acétique). Un éluant plus polaire entraîne davantage tous les composés. La phase inverse (silice greffée C18, apolaire, éluant aqueux polaire) inverse cet ordre : les composés apolaires sont les plus retenus.
La chromatographie sur couche mince (CCM) utilise une plaque d'aluminium ou de verre recouverte d'une fine couche de silice. On dépose le mélange au capillaire sur la ligne de base, on place la plaque dans une cuve saturée en vapeurs d'éluant, on laisse migrer jusqu'au front, puis on révèle (UV, iode, ninhydrine pour les acides aminés, acide sulfurique). Chaque composé est caractérisé par son rapport frontal Rf = distance parcourue par le composé / distance parcourue par le front de l'éluant, compris entre 0 et 1, reproductible dans des conditions données et permettant l'identification par comparaison avec un témoin.
4. Grandeurs de rétention : K, tR, k et α
Sur colonne, le détecteur trace un chromatogramme : signal en fonction du temps, formé de pics gaussiens. Le coefficient de distribution K = CS / CM est le rapport des concentrations du soluté dans la phase stationnaire et la phase mobile à l'équilibre. Le temps de rétention tR est le temps écoulé entre l'injection et le sommet du pic ; le temps mort tM (ou t0) est celui d'un composé non retenu, qui traverse la colonne à la vitesse de la phase mobile. On en déduit le temps de rétention réduit t'R = tR − tM et le facteur de rétention k = (tR − tM) / tM, indépendant du débit et de la longueur de colonne, idéalement compris entre 1 et 10. Le facteur de sélectivité α = k2 / k1 (toujours supérieur ou égal à 1) mesure l'aptitude de la colonne à séparer deux solutés ; α = 1 signifie une co-élution.
5. Efficacité : plateaux théoriques et HEPT
La théorie des plateaux assimile la colonne à une succession de N étages d'équilibre. Plus N est grand, plus les pics sont fins pour un même temps de rétention. On calcule N à partir d'un pic : N = 16 (tR / w)2 avec w la largeur du pic à la base, ou N = 5,54 (tR / w1/2)2 avec la largeur à mi-hauteur. La hauteur équivalente à un plateau théorique H = L / N (L longueur de colonne) caractérise l'efficacité intrinsèque du garnissage : plus H est petite, meilleure est la colonne. La théorie cinétique (équation de van Deemter) explique que H dépend du débit de phase mobile : H = A + B/u + C·u, avec A la diffusion turbulente liée à la taille et à l'homogénéité des particules, B la diffusion longitudinale (prédominante à faible débit) et C la résistance au transfert de masse (prédominante à fort débit). Il existe donc un débit optimal, et les particules fines des colonnes HPLC réduisent A et C, ce qui explique leur efficacité.
6. La résolution
La résolution quantifie la séparation de deux pics voisins : Rs = 2 (tR2 − tR1) / (w1 + w2). Pour Rs = 1, les pics se chevauchent d'environ 2 % ; pour Rs ≥ 1,5, la séparation est considérée comme complète (retour à la ligne de base). L'équation fondamentale relie la résolution aux trois leviers : Rs = (√N / 4) × ((α − 1) / α) × (k / (1 + k)). On améliore donc une séparation en augmentant l'efficacité N (colonne plus longue ou particules plus fines, mais la résolution ne croît qu'avec √N), la sélectivité α (changer la phase stationnaire ou la composition de l'éluant, levier le plus puissant) ou la rétention k (éluant moins fort, sans dépasser k ≈ 10 pour ne pas allonger l'analyse). En élution par gradient, on augmente progressivement la force de l'éluant au cours de l'analyse pour éluer en un temps raisonnable des composés de rétentions très différentes.
La phase stationnaire est le support fixe (solide, gel ou liquide immobilisé) qui retient les solutés ; la phase mobile (éluant liquide, gaz ou fluide supercritique) les entraîne à travers elle.
Rapport (tR − tM) / tM, égal au rapport des quantités de soluté dans la phase stationnaire et dans la phase mobile ; il mesure la rétention indépendamment du débit et de la longueur de colonne.
| Grandeur | Formule | Signification | Valeur souhaitable |
|---|---|---|---|
| Rapport frontal Rf | d soluté / d front | Migration en CCM | Entre 0,2 et 0,8 |
| Facteur de rétention k | (tR − tM) / tM | Rétention d'un soluté | 1 à 10 |
| Sélectivité α | k2 / k1 | Aptitude à distinguer deux solutés | > 1 |
| Plateaux N | 16 (tR / w)² | Finesse des pics, efficacité | Le plus grand possible |
| HEPT H | L / N | Efficacité par unité de longueur | La plus petite possible |
| Résolution Rs | 2 (tR2 − tR1) / (w1 + w2) | Qualité de la séparation | ≥ 1,5 |
Les grandeurs chromatographiques à connaître
- Chromatographie = migration différentielle des solutés entre une phase stationnaire qui retient et une phase mobile qui entraîne.
- Classification par phase mobile (CPL, CPG, CFS), par support (planaire, colonne) et par mécanisme (adsorption, partage, échange d'ions, exclusion, affinité).
- En adsorption sur silice, le composé le plus polaire est le plus retenu ; en phase inverse C18, c'est l'inverse.
- k = (tR − tM)/tM ; α = k2/k1 ; N = 16 (tR/w)² ; H = L/N ; Rs = 2 ΔtR / (w1 + w2), séparation complète si Rs ≥ 1,5.
- Van Deemter : H = A + B/u + C·u, d'où un débit optimal ; la sélectivité est le levier le plus efficace pour améliorer la résolution.
Prépare-toi à un exercice numérique à partir d'un chromatogramme : calculer k, α, N et Rs pour deux pics, puis conclure si la séparation est satisfaisante (Rs ≥ 1,5). On demande aussi de prévoir l'ordre d'élution de composés de polarités différentes sur silice, puis en phase inverse, et de calculer un Rf en CCM. Piège classique : oublier de soustraire le temps mort dans k, ou inverser l'ordre d'élution entre phase normale et phase inverse.