Avant toute extraction, il faut libérer les biomolécules de leur compartiment d'origine tout en préservant leur structure. Ce chapitre décrit les précautions de prélèvement puis les méthodes de broyage et de lyse adaptées à l'animal entier, à la plante et aux cultures microbiennes. Le choix de la méthode en fonction du matériel est un classique des questions de raisonnement à l'examen.
1. Objectifs et précautions générales
La préparation du matériel biologique vise à obtenir un homogénat ou un extrait brut représentatif de l'échantillon, dans lequel l'analyte est libéré, soluble et stable. Dès le prélèvement, le biosystème est perturbé : la mort cellulaire libère des protéases, nucléases et phénoloxydases, et le métabolisme continue quelques minutes. On travaille donc à froid (0 à 4 °C, glace pilée), rapidement, et dans un tampon qui maintient le pH près de la neutralité physiologique. L'échantillon qui ne peut pas être traité immédiatement est congelé à −20 °C, ou mieux à −80 °C, voire dans l'azote liquide (−196 °C) pour bloquer instantanément toute activité enzymatique.
La méthode de rupture doit être adaptée à la résistance de l'enveloppe (membrane plasmique seule, paroi cellulosique, paroi de peptidoglycane) et à la fragilité de l'analyte : on ne traite pas de la même façon une petite molécule stable (glucose, acide gras) et une enzyme ou un ADN de haut poids moléculaire, cisaillé par une agitation trop violente. Une lyse trop brutale libère aussi les enzymes lysosomales et vacuolaires, qui dégradent l'extrait.
2. L'animal entier et les tissus animaux
Chez l'animal, on part soit de fluides biologiques (sang recueilli sur anticoagulant puis centrifugé pour séparer plasma et cellules ; urine ; lait), soit d'un organe prélevé après dissection. L'organe est rincé et souvent perfusé avec du sérum physiologique froid pour éliminer le sang, puis découpé en petits fragments. Les cellules animales n'ont pas de paroi : un broyage doux suffit. L'homogénéiseur de Potter-Elvehjem (piston de téflon tournant dans un tube de verre) cisaille les membranes plasmiques en préservant noyaux et mitochondries ; c'est l'outil du fractionnement subcellulaire. L'Ultra-Turrax (broyeur à couteaux rotatifs à grande vitesse) est plus énergique et convient aux tissus fibreux (muscle, foie) quand on ne cherche pas à conserver les organites intacts.
3. La plante et les tissus végétaux
Le matériel végétal pose trois difficultés. La paroi cellulosique est rigide : il faut un broyage mécanique énergique, au mortier avec du sable de Fontainebleau ou de l'alumine comme abrasif, ou après congélation dans l'azote liquide qui rend le tissu cassant et se réduit en poudre fine. La vacuole occupe la majorité du volume cellulaire ; sa rupture libère des acides organiques qui acidifient l'extrait, d'où l'emploi de tampons à forte concentration. Enfin les tissus végétaux sont riches en composés phénoliques et en phénoloxydases : à la lyse, les phénols sont oxydés en quinones brunes qui se fixent aux protéines et les inactivent. On ajoute donc de la PVPP (polyvinylpolypyrrolidone), qui adsorbe les phénols, et des réducteurs comme l'acide ascorbique ou le β-mercaptoéthanol.
Lorsqu'on veut obtenir des cellules végétales vivantes dépourvues de paroi, les protoplastes, on remplace le broyage par une digestion enzymatique douce avec des cellulases et des pectinases dans un milieu osmotiquement stabilisé (mannitol ou sorbitol), sans quoi les protoplastes éclateraient.
4. Les cultures microbiennes
Les bactéries et levures sont récoltées par centrifugation de la culture puis lavées. Leur paroi (peptidoglycane, ou glucanes et mannanes chez les levures) est résistante et les cellules sont petites, ce qui rend la lyse plus difficile. Les méthodes mécaniques sont la sonication (ultrasons créant des bulles de cavitation, par cycles courts sur glace pour éviter l'échauffement), la presse de French (la suspension est forcée sous très haute pression à travers un orifice étroit, la décompression brutale éclate les cellules) et le broyage aux billes de verre par vortex ou bead-beater, très efficace sur les levures. Les cycles de congélation-décongélation et le choc osmotique (passage brutal d'un milieu hypertonique à l'eau distillée) sont des méthodes douces réservées aux cellules fragiles ou à la libération du contenu périplasmique.
5. Méthodes chimiques et enzymatiques de lyse
Le lysozyme hydrolyse les liaisons β(1→4) du peptidoglycane ; il lyse facilement les bactéries à Gram positif, et les Gram négatif si l'on ajoute de l'EDTA qui déstabilise la membrane externe en chélatant Mg2+ et Ca2+. Les levures sont traitées par la zymolyase ou la lyticase. Les détergents solubilisent les membranes en formant des micelles mixtes avec les lipides : détergents non ioniques doux (Triton X-100, Tween 20, octylglucoside) qui respectent les protéines membranaires, détergents zwitterioniques (CHAPS), ou détergent anionique fort (SDS) qui dénature tout et n'est utilisé que pour extraire des acides nucléiques ou préparer un SDS-PAGE. Les solvants organiques (toluène, chloroforme) perméabilisent aussi les membranes mais dénaturent les protéines.
6. Le milieu d'homogénéisation
Le tampon de lyse est conçu pour l'objectif visé. Pour un fractionnement subcellulaire, il doit être isotonique (saccharose 0,25 M ou mannitol) afin que les organites ne gonflent ni n'éclatent, tamponné à pH 7,2 à 7,6 (Tris-HCl, phosphate, HEPES) et de faible force ionique. On y ajoute selon les besoins des inhibiteurs de protéases (PMSF, EDTA, cocktails commerciaux), un agent réducteur (DTT, β-mercaptoéthanol) qui protège les groupements thiols, du Mg2+ pour stabiliser les ribosomes, ou au contraire de l'EDTA pour inhiber les nucléases dépendantes du magnésium. L'homogénat obtenu est ensuite filtré sur gaze pour éliminer les débris grossiers, puis engagé dans les étapes de centrifugation et d'extraction des chapitres suivants.
Suspension obtenue après broyage d'un tissu dans un tampon, contenant les cellules rompues, les organites libérés et les molécules solubles du cytosol.
Cellule végétale ou bactérienne dont la paroi a été éliminée par digestion enzymatique (cellulase-pectinase ou lysozyme), délimitée seulement par sa membrane plasmique et donc osmotiquement fragile.
| Méthode | Principe | Matériel adapté | Limite |
|---|---|---|---|
| Potter-Elvehjem | Cisaillement piston-tube | Tissus animaux mous, organites | Inefficace sur parois |
| Mortier + azote liquide | Broyage cryogénique | Feuilles, graines, tissus durs | Long, manuel |
| Sonication | Cavitation par ultrasons | Bactéries, petits volumes | Échauffement, cisaillement de l'ADN |
| Presse de French | Décompression brutale | Bactéries, levures | Appareil coûteux |
| Lysozyme ± EDTA | Hydrolyse du peptidoglycane | Bactéries Gram +, Gram − avec EDTA | Coût, contamination protéique |
| Détergents (Triton, SDS) | Solubilisation des lipides | Membranes, acides nucléiques | SDS dénaturant |
Choisir une méthode de rupture cellulaire
- Travailler vite, à froid (0 à 4 °C), en tampon, avec inhibiteurs de protéases : la lyse libère des enzymes qui dégradent l'analyte.
- Cellule animale sans paroi → broyage doux (Potter) ; cellule végétale à paroi → broyage abrasif ou cryogénique + PVPP contre les phénols.
- Microorganismes → sonication, presse de French, billes de verre, ou lysozyme (+ EDTA pour les Gram −).
- Protoplastes = cellules sans paroi, obtenus par cellulase-pectinase en milieu osmotiquement stabilisé.
- Tampon isotonique (saccharose 0,25 M) et pH physiologique pour conserver les organites intacts.
Le sujet type propose un matériel (feuille, foie, culture de levure) et demande de justifier la méthode de broyage, le tampon et les additifs. Pense toujours à citer trois choses : la paroi (ou son absence), les enzymes libérées (protéases, phénoloxydases) et la conservation des organites (isotonie). Le piège habituel est d'oublier que le SDS dénature les protéines et ne convient pas à une purification d'enzyme active.