La sédimentation sépare les constituants d'une suspension selon leur taille, leur forme et leur densité. Ce chapitre part de la décantation par simple gravité et de la loi de Stokes, puis explique comment la centrifugation multiplie cette force pour fractionner cellules, organites et macromolécules. Les formules de la RCF et le schéma de centrifugation différentielle sont des incontournables de l'examen.
1. Décantation et sédimentation par gravité
La décantation est une séparation mécanique sous l'effet de la seule pesanteur. Elle sépare soit deux liquides non miscibles de densités différentes (le plus dense se place en dessous, comme dans l'ampoule à décanter après une extraction), soit des particules solides insolubles en suspension dans un liquide, qui tombent au fond (sédiment) ou remontent en surface selon leur densité. Elle est employée en traitement des eaux (dessablage, déshuilage) et au laboratoire pour éliminer un précipité grossier. Une particule en sédimentation est soumise à trois forces : son poids, la poussée d'Archimède et la force de frottement visqueux, qui s'oppose au mouvement.
2. La loi de Stokes
Pour une particule sphérique de rayon r, la vitesse limite de sédimentation, atteinte quand les trois forces s'équilibrent, est donnée par la loi de Stokes : v = 2 r2 g (ρp − ρf) / 9 η, où g est l'accélération de la pesanteur, ρp et ρf les masses volumiques de la particule et du fluide, et η la viscosité du fluide (en Pa·s). Trois enseignements : la vitesse croît avec le carré du rayon (une particule deux fois plus grosse sédimente quatre fois plus vite), elle est proportionnelle à la différence de densité (une particule de même densité que le fluide ne sédimente pas), et elle est inversement proportionnelle à la viscosité. Pour les particules microscopiques et les macromolécules, l'agitation moléculaire (mouvement brownien) domine largement la gravité : elles ne sédimentent jamais spontanément. Il faut alors augmenter g.
3. Principe de la centrifugation et force centrifuge relative
En faisant tourner l'échantillon, on crée une force centrifuge dirigée radialement vers l'extérieur de l'axe de rotation, dont l'accélération vaut ω2 r (ω vitesse angulaire, r distance à l'axe). On l'exprime en multiples de g : c'est la force centrifuge relative (RCF), calculée par RCF = 1,118 × 10−5 × r × N2, avec r en centimètres et N en tours par minute (rpm). Deux conséquences pratiques : la RCF dépend du rayon du rotor, donc une consigne en rpm n'a de sens que pour un rotor donné, et un protocole doit toujours être exprimé en g ; par ailleurs, doubler la vitesse de rotation quadruple la force. La loi de Stokes reste valable en remplaçant g par ω2 r.
On distingue les centrifugeuses de paillasse (quelques milliers de g), les centrifugeuses réfrigérées à haute vitesse (jusqu'à environ 20 000 à 50 000 g) et les ultracentrifugeuses (au-delà de 100 000 g, jusqu'à plusieurs centaines de milliers de g), qui tournent sous vide pour éviter l'échauffement par frottement de l'air. Les rotors à angle fixe sédimentent vite, le culot se formant contre la paroi ; les rotors à godets oscillants (swinging bucket) alignent les tubes sur le rayon pendant la rotation et sont réservés aux gradients de densité. Les tubes doivent toujours être équilibrés deux à deux.
4. Coefficient de sédimentation et unité Svedberg
La vitesse de sédimentation d'une particule rapportée à l'accélération appliquée définit son coefficient de sédimentation s = v / (ω2 r), homogène à un temps. Il s'exprime en Svedberg (1 S = 10−13 s), du nom de l'inventeur de l'ultracentrifugeuse. Le coefficient dépend de la masse, de la densité et de la forme de la particule (une molécule compacte sédimente plus vite qu'une molécule allongée de même masse), c'est pourquoi les valeurs ne s'additionnent pas : les sous-unités ribosomiques 30S et 50S forment un ribosome 70S chez les procaryotes, 40S et 60S un ribosome 80S chez les eucaryotes. L'ultracentrifugation analytique mesure s en temps réel par un système optique et permet de déterminer la masse molaire des macromolécules.
5. La centrifugation différentielle
C'est la méthode de base du fractionnement subcellulaire. L'homogénat est soumis à des centrifugations successives de force et de durée croissantes ; à chaque étape, le culot contient les particules les plus grosses ou les plus denses et le surnageant est recentrifugé. Avec un homogénat de foie en saccharose 0,25 M : une centrifugation de faible force (de l'ordre de 1 000 g pendant 10 minutes) culotte les noyaux, les cellules intactes et les débris ; une force moyenne (de l'ordre de 10 000 à 20 000 g, 20 minutes) culotte mitochondries, lysosomes et peroxysomes ; une force élevée (environ 100 000 g pendant une heure) culotte la fraction microsomale (vésicules du réticulum, membranes, ribosomes) ; le surnageant final est le cytosol soluble. Chaque fraction est contrôlée par un enzyme marqueur (succinate déshydrogénase pour la mitochondrie, phosphatase acide pour le lysosome, glucose-6-phosphatase pour le réticulum). Ses limites : les fractions sont contaminées les unes par les autres, car les particules sédimentent selon leur position initiale dans le tube.
6. La centrifugation en gradient de densité
Pour affiner la séparation, on dépose l'échantillon sur un gradient de densité préformé ou autoformé (saccharose, Ficoll, Percoll, chlorure de césium). En centrifugation zonale (ou de vitesse), l'échantillon est déposé en couche mince au sommet d'un gradient de saccharose peu dense ; les particules migrent en bandes à des vitesses dépendant de leur taille et de leur forme, et la centrifugation est arrêtée avant que les bandes n'atteignent le fond. En centrifugation isopycnique (à l'équilibre), le gradient couvre toute la gamme des densités des particules ; chaque particule migre jusqu'à la zone où la densité du milieu égale la sienne et s'y immobilise, quel que soit le temps de centrifugation. Le gradient de CsCl a servi à l'expérience historique de Meselson et Stahl sur la réplication semi-conservative de l'ADN, et sépare toujours ADN, ARN et protéines selon leur densité. Les fractions sont ensuite collectées par perçage du fond du tube ou par pompage.
Accélération centrifuge exprimée en multiples de l'accélération de la pesanteur g ; elle dépend du rayon du rotor et du carré de la vitesse de rotation (RCF = 1,118 × 10−5 × r × N2).
Centrifugation en gradient de densité poursuivie jusqu'à l'équilibre, où chaque particule s'immobilise à la position où la densité du milieu est égale à la sienne.
| Étape | Force et durée approximatives | Culot obtenu | Enzyme marqueur |
|---|---|---|---|
| 1 | ≈ 1 000 g, 10 min | Noyaux, débris, cellules entières | ADN polymérase |
| 2 | ≈ 10 000 à 20 000 g, 20 min | Mitochondries, lysosomes, peroxysomes | Succinate déshydrogénase |
| 3 | ≈ 100 000 g, 60 min | Microsomes (RE, membranes, ribosomes) | Glucose-6-phosphatase |
| Surnageant final | — | Cytosol (enzymes solubles) | Lactate déshydrogénase |
Fractionnement subcellulaire par centrifugation différentielle (ordres de grandeur)
- Loi de Stokes : v = 2 r² g (ρp − ρf) / 9 η ; la vitesse croît avec r², avec la différence de densité, et diminue avec la viscosité.
- RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × r(cm) × N²(rpm) ; toujours exprimer un protocole en g, jamais seulement en rpm.
- Coefficient de sédimentation en Svedberg (1 S = 10⁻¹³ s) ; non additif (30S + 50S = 70S).
- Centrifugation différentielle : forces croissantes → noyaux, mitochondries, microsomes, cytosol.
- Zonale = séparation par vitesse (taille, forme) arrêtée avant l'équilibre ; isopycnique = séparation par densité à l'équilibre.
Deux exercices classiques : convertir des rpm en g avec la formule de la RCF (attention au rayon en cm), et calculer un rayon ou une vitesse de sédimentation avec la loi de Stokes (unités SI). Le schéma de centrifugation différentielle avec les organites de chaque culot et leur enzyme marqueur est un incontournable. Piège fréquent : croire que les coefficients de Svedberg s'additionnent, ou confondre centrifugation zonale et isopycnique.