Avant d'étudier un gène, il faut l'extraire, le doser, le séparer et le repérer. Ce chapitre décrit les techniques usuelles de laboratoire : lyse et purification, contrôle de qualité par spectrophotométrie, électrophorèse en gel, marquage des sondes et hybridation sur membrane. Ces protocoles sont la matière des TP et reviennent en examen sous forme de questions sur le rôle d'un réactif ou l'interprétation d'un profil de migration.
1. Extraction et purification de l'ADN
L'extraction comprend trois temps. La lyse cellulaire libère le contenu de la cellule : détergent SDS qui solubilise les membranes, tampon Tris-EDTA dans lequel l'EDTA chélate les ions Mg2+ et inhibe ainsi les DNases, et parfois un broyage mécanique ou une digestion enzymatique de la paroi (lysozyme pour les bactéries, cellulase pour les végétaux). Vient ensuite l'élimination des protéines par la protéinase K puis par une extraction au mélange phénol-chloroforme : après centrifugation, les protéines dénaturées forment une interphase blanchâtre, les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse supérieure.
La dernière étape est la précipitation des acides nucléiques par de l'éthanol absolu froid (ou de l'isopropanol) en présence de sels monovalents (acétate de sodium), suivie d'un lavage à l'éthanol à 70 % pour éliminer les sels, puis d'une reprise dans un tampon. Les protocoles modernes remplacent souvent le phénol par des colonnes de silice : en présence de sels chaotropiques, l'ADN s'adsorbe sur la silice, les contaminants sont éliminés par lavage, puis l'ADN est élué à faible force ionique. On ajoute fréquemment une RNase A pour supprimer l'ARN contaminant.
2. Extraction de l'ARN : précautions particulières
L'ARN est beaucoup plus fragile que l'ADN, à cause de l'hydroxyle en 2' du ribose et surtout des RNases, très stables et omniprésentes (mains, poussières, verrerie). Le travail impose des gants, du matériel stérile à usage unique et des solutions traitées. La méthode de référence utilise le thiocyanate de guanidinium, agent chaotropique qui dénature immédiatement les RNases, associé au phénol acide : dans ces conditions, l'ADN passe dans la phase organique et l'interphase, l'ARN reste seul dans la phase aqueuse. Pour étudier l'expression des gènes, on purifie souvent les ARNm à partir de l'ARN total grâce à leur queue poly-A, retenue sur une colonne d'oligo-dT.
3. Dosage et contrôle de la pureté
Les bases azotées absorbent le rayonnement ultraviolet avec un maximum à 260 nm ; les protéines absorbent surtout à 280 nm (résidus aromatiques). Par convention, une unité d'absorbance à 260 nm correspond à environ 50 µg/mL d'ADN double brin et 40 µg/mL d'ARN. Le rapport A260/A280 renseigne sur la pureté : voisin de 1,8 pour un ADN propre, de 2,0 pour un ARN propre ; une valeur nettement inférieure trahit une contamination protéique ou phénolique. Le rapport A260/A230 détecte les résidus de sels et de solvants. L'intégrité, elle, ne se juge pas au spectrophotomètre mais sur gel.
4. Électrophorèse et séparation des acides nucléiques
Les acides nucléiques sont chargés négativement de façon uniforme grâce à leurs groupements phosphate : dans un champ électrique, ils migrent tous vers l'anode (pôle positif), et la séparation ne dépend donc que de la taille et de la conformation. Le gel d'agarose (typiquement 0,7 à 2 %) sépare des fragments allant de quelques centaines de paires de bases à plusieurs dizaines de kilobases : plus le fragment est grand, plus il est freiné par le maillage et moins il migre. Le gel de polyacrylamide, à maillage plus fin, résout des fragments courts, jusqu'au nucléotide près en conditions dénaturantes — c'est le gel du séquençage manuel.
La révélation se fait par un agent intercalant fluorescent sous UV, le bromure d'éthidium (mutagène, aujourd'hui souvent remplacé par des colorants moins dangereux). La taille des bandes s'estime par comparaison avec un marqueur de taille déposé en parallèle. Attention : pour un même nombre de paires de bases, un plasmide superenroulé migre plus vite que la même molécule circulaire relâchée ou linéarisée — la conformation compte autant que la masse.
Fragment d'acide nucléique simple brin, de séquence connue et marqué, capable de s'hybrider spécifiquement à une séquence complémentaire pour la localiser dans un mélange complexe.
5. Le marquage des acides nucléiques
Le marquage radioactif historique utilise le phosphore 32P ou le soufre 35S incorporés dans les nucléotides ; il est très sensible mais impose des contraintes de radioprotection et une révélation par autoradiographie. Les marquages non radioactifs l'ont largement remplacé : nucléotides couplés à la digoxigénine ou à la biotine, révélés par un anticorps ou par la streptavidine conjugués à une enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase) produisant un signal coloré ou chimioluminescent ; ou nucléotides couplés à un fluorochrome.
Trois stratégies d'incorporation sont classiques : la nick translation, où la DNase I crée des coupures ponctuelles que l'ADN polymérase I comble en incorporant des nucléotides marqués ; le marquage par amorçage aléatoire (random priming), qui utilise des hexanucléotides de séquence aléatoire et le fragment de Klenow ; et le marquage terminal par la polynucléotide kinase T4, qui transfère un phosphate marqué sur l'extrémité 5'. La PCR permet également de synthétiser directement une sonde marquée.
6. Southern, Northern et Western : les transferts sur membrane
Le Southern blot, mis au point par Edwin Southern, consiste à digérer l'ADN par des enzymes de restriction, à le séparer par électrophorèse, à le dénaturer dans le gel, à le transférer par capillarité sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose, puis à l'hybrider avec une sonde marquée : il révèle la présence, le nombre de copies et l'organisation d'un gène. Le Northern blot applique le même principe aux ARN et mesure le niveau d'expression d'un gène ainsi que la taille du transcrit. Le Western blot, lui, porte sur les protéines séparées en SDS-PAGE et révélées par des anticorps : il n'utilise pas de sonde nucléique. La puce à ADN et la RT-PCR quantitative sont les versions modernes et parallélisées du Northern.
| Technique | Molécule analysée | Révélation | Information obtenue |
|---|---|---|---|
| Southern | ADN | Sonde nucléique | Présence et organisation d'un gène |
| Northern | ARN | Sonde nucléique | Niveau d'expression, taille du transcrit |
| Western | Protéine | Anticorps | Présence et taille d'une protéine |
Les trois transferts à ne pas confondre
- Extraction ADN : lyse (SDS, EDTA) → protéinase K et phénol-chloroforme → précipitation à l'éthanol froid + sels.
- L'EDTA chélate le Mg²⁺ et bloque les DNases ; le thiocyanate de guanidinium neutralise les RNases.
- Dosage à 260 nm : 1 DO ≈ 50 µg/mL d'ADN double brin, 40 µg/mL d'ARN ; A260/A280 ≈ 1,8 (ADN) et 2,0 (ARN).
- Les acides nucléiques migrent vers l'anode ; agarose pour les grands fragments, polyacrylamide pour la haute résolution.
- Un plasmide superenroulé migre plus vite que le même plasmide linéarisé.
- Southern = ADN, Northern = ARN, Western = protéine (anticorps, pas de sonde).
Dans les facultés marocaines, ce chapitre tombe surtout en TP noté et en QCM : rôle précis de chaque réactif d'extraction, calcul d'une concentration à partir d'une DO, interprétation d'un rapport A260/A280 trop bas. Le piège récurrent est l'inversion Southern / Northern / Western — retiens que seul le Western utilise des anticorps. Deuxième piège : croire que la migration dépend de la charge, alors que le rapport charge/masse est constant et que seule la taille (et la conformation) sépare les fragments.