Fiche de révision · S5
Résumé — Biologie moléculaire
Tout le module en une page : les chapitres condensés en points essentiels, le vocabulaire et les pièges d'examen. Pour la veille de l'épreuve.
1
Introduction à la biologie moléculaire et structure des acides nucléiques
- Dogme central : ADN → réplication ADN, ADN → transcription ARN, ARN → traduction protéine ; ARN → ADN par transcriptase inverse chez les rétrovirus.
- Nucléotide = base + ose + phosphate ; liaison phosphodiester 5'→3' ; toute polymérase allonge par l'extrémité 3'-OH en libérant un pyrophosphate.
- Double hélice (Watson et Crick 1953) : brins antiparallèles et complémentaires, A=T (2 liaisons H) vs G≡C (3 liaisons H) ; règles de Chargaff.
- ADN B : diamètre ≈ 2 nm, 0,34 nm entre bases, ≈ 10 pb par tour → pas ≈ 3,4 nm ; grand et petit sillons.
- Nucléosome ≈ 146 pb autour d'un octamère H2A-H2B-H3-H4 (+ H1) → fibre 11 nm → fibre 30 nm → chromosome ; Tm augmente avec le % G+C.
2
Méthodes d'étude des acides nucléiques : extraction, électrophorèse, marquage
- Extraction ADN : lyse (SDS, EDTA qui chélate Mg²⁺ et bloque les DNases) → protéinase K + phénol-chloroforme → précipitation éthanol froid + sels.
- ARN : thiocyanate de guanidinium contre les RNases ; purification des ARNm sur colonne oligo-dT grâce à la queue poly-A.
- Dosage : 1 DO à 260 nm ≈ 50 µg/mL d'ADN double brin vs 40 µg/mL d'ARN ; A260/A280 ≈ 1,8 (ADN) et ≈ 2,0 (ARN).
- Électrophorèse : migration vers l'anode, agarose pour les grands fragments vs polyacrylamide pour la haute résolution ; plasmide superenroulé plus rapide que linéarisé.
- Marquage : nick translation, random priming, kinase T4 ; sondes radioactives (³²P) ou froides (digoxigénine, biotine).
- Southern = ADN, Northern = ARN (sonde nucléique) vs Western = protéine (anticorps).
3
Enzymes de restriction et vecteurs de clonage
- Système restriction-modification : l'endonucléase coupe l'ADN étranger, la méthylase protège l'ADN de l'hôte ; nomenclature EcoRI = Escherichia coli souche R.
- Seules les enzymes de type II servent au clonage : site palindromique de 4 à 8 pb, coupure reproductible, cofacteur Mg²⁺, pas d'ATP.
- Bouts cohésifs (EcoRI, G/AATTC) vs bouts francs (SmaI, CCC/GGG) ; les extrémités cohésives se religaturent bien plus facilement.
- Plasmide : ADN circulaire extrachromosomique, ori autonome, présence facultative, marqueurs (résistance aux antibiotiques, colicines, facteur F).
- pUC18/19 = 2686 pb, MCS dans lacZ, AmpR → sélection blanc (recombinant) / bleu (vecteur vide) sur X-Gal + IPTG.
- Capacité croissante : plasmide (quelques kb) → phage λ EMBL (≈ 23 kb) → cosmide → BAC → YAC ; ligation par l'ADN ligase T4, transformation par CaCl₂ ou électroporation.
4
Amplification par PCR et séquençage de l'ADN
- Cycle PCR : dénaturation 94-95 °C → hybridation 50-65 °C → élongation 72 °C ; amplification ≈ 2ⁿ puis plateau.
- Mélange : matrice, deux amorces orientées l'une vers l'autre, dNTP, Taq polymérase (Thermus aquaticus, sans relecture 3'→5'), tampon, Mg²⁺.
- Spécificité pilotée par la température d'hybridation et la concentration en Mg²⁺ ; témoins positif et négatif obligatoires.
- RT-PCR : ARN → ADNc → amplification ; qPCR : quantification en temps réel par fluorescence (cycle seuil) ; PCR nichée et multiplex.
- Sanger : les ddNTP, dépourvus d'OH en 3', stoppent l'élongation → fragments de toutes tailles séparés au nucléotide près.
- Version automatisée : 4 fluorochromes, une seule réaction, électrophorèse capillaire, électrophérogramme ; NGS pour le haut débit.
5
La réplication de l'ADN chez les procaryotes et les eucaryotes
- Réplication semi-conservative démontrée par Meselson et Stahl (1957) : ¹⁵N → ¹⁴N, gradient de CsCl, bande intermédiaire à la 1ʳᵉ génération.
- Procaryotes : origine unique oriC ≈ 245 pb reconnue par DnaA, réplication bidirectionnelle, 250 à 1000 nucléotides/seconde, séquence de terminaison.
- Enzymes : hélicase DnaB (déroule) → gyrase (surenroulement) → SSB (stabilise) → primase DnaG (amorce ARN) → ADN pol III (synthèse) → pol I (retire l'amorce) → ligase (soude).
- Synthèse toujours 5'→3' sur une extrémité 3'-OH : brin précoce continu vs brin retardé discontinu (fragments d'Okazaki).
- Eucaryotes : phase S, origines multiples, pol α/primase + pol δ et ε (pol γ pour la mitochondrie), réassemblage des nucléosomes.
- Télomères et télomérase compensent le raccourcissement des chromosomes linéaires ; fidélité = sélection + relecture 3'→5' + réparation des mésappariements.
6
La transcription et la maturation des ARN
- Un seul brin transcrit (brin matrice, lu 3'→5') ; l'ARN a la séquence du brin non transcrit avec U à la place de T.
- L'ARN polymérase ADN-dépendante n'a pas besoin d'amorce et ne relit pas ; elle exige la matrice, les NTP et le Mg²⁺.
- Procaryotes : une seule ARN polymérase + facteur σ ; promoteur -10 (TATAAT, boîte de Pribnow) et -35 (TTGACA) ; ARNm souvent polycistronique.
- Terminaison Rho-indépendante (épingle à cheveux riche en G-C suivie de poly-U) vs Rho-dépendante (hélicase ARN-ADN ATP-dépendante).
- Eucaryotes : pol I → ARNr 28S/18S/5,8S, pol II → ARNm (très sensible à l'α-amanitine), pol III → ARNt et ARNr 5S ; boîte TATA ≈ -30 reconnue par TBP/TFIID, enhancers.
- Maturation : coiffe 7-méthylguanosine en 5' par liaison 5'-5' (co-transcriptionnelle), queue poly-A de 50 à 250 A en 3', épissage GU-AG par le spliceosome (snRNP) et épissage alternatif.
7
La traduction et le code génétique
- 64 codons = 61 sens + 3 stop (UAA, UAG, UGA) ; AUG = codon initiateur et méthionine ; ORF entre AUG et stop.
- Code non chevauchant, sans virgule, dégénéré (3ᵉ base flottante, wobble), non ambigu, quasi universel → mutations silencieuses possibles.
- ARNt : feuille de trèfle puis L, anticodon antiparallèle au codon, acide aminé estérifié sur l'extrémité 3'-CCA par une aminoacyl-ARNt synthétase (ATP).
- Ribosome 70S = 30S + 50S (procaryotes) vs 80S = 40S + 60S (eucaryotes) ; sites A (entrée), P (chaîne en croissance), E (sortie).
- Initiation : Shine-Dalgarno + formyl-méthionine chez les procaryotes vs coiffe et balayage + méthionine chez les eucaryotes.
- Élongation = fixation en A → liaison peptidique (peptidyl transférase = ARNr, ribozyme) → translocation ; terminaison par RF1/RF2/RF3 (eRF1 chez les eucaryotes) ; synthèse N-terminale → C-terminale.
8
La régulation de l'expression génétique chez les bactéries : opérons lactose et tryptophane
- Opéron (Jacob et Monod) = promoteur + opérateur + gènes de structure → un ARNm polycistronique ; gène régulateur exprimé de façon constitutive.
- Opéron lac : lacZ → β-galactosidase, lacY → perméase, lacA → transacétylase ; lacI → répresseur allostérique.
- Sans lactose : répresseur actif fixé sur l'opérateur → pas de transcription ; avec lactose : l'allolactose inactive le répresseur → transcription (système inductible).
- Répression catabolique : glucose présent → AMPc bas → pas de complexe AMPc-CAP → transcription faible ; expression maximale = lactose présent ET glucose absent.
- Mutants : Oc constitutif dominant en cis, I⁻ constitutif récessif (I⁺ dominant car diffusible, agit en trans), Is super-répresseur → opéron éteint même avec lactose.
- Opéron trp : 5 gènes trpE-D-C-B-A, système répressible, tryptophane = corépresseur activant le répresseur ; second niveau = atténuation (terminaison prématurée).
Vocabulaire à connaître par cœur
- Gène
- Unité fonctionnelle de l'information génétique.
- Nucléosome
- ADN d'environ 146 pb enroulé autour d'un octamère d'histones.
- Tm
- Température à laquelle la moitié de l'ADN est dénaturée en simples brins.
- Palindrome
- Séquence identique lue 5'→3' sur les deux brins, site des enzymes de restriction de type II.
- Plasmide
- ADN circulaire extrachromosomique à réplication autonome, utilisé comme vecteur.
- Amorce
- Court oligonucléotide fournissant l'extrémité 3'-OH nécessaire à une polymérase.
- Fragment d'Okazaki
- Segment court synthétisé de façon discontinue sur le brin retardé.
- Télomérase
- Transcriptase inverse à ARN matrice qui allonge les extrémités des chromosomes.
- Promoteur
- Région en amont du gène où se fixe l'ARN polymérase.
- Épissage
- Excision des introns et raboutage des exons d'un ARN pré-messager.
- Codon
- Triplet de nucléotides spécifiant un acide aminé ou un signal stop.
- Opéron
- Groupe de gènes bactériens transcrits ensemble sous un même contrôle.