Électrophorèse – Western Blot – Comment ça marche ? SUPER VIDEO EXPLICATIVE

Bonjour

Vous allez trouver ici une vidéo qui explique l'électrophorèse (Western blot).

Le western blot est une méthode de biologie moléculaire permettant la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique (sérum ou autre extrait ou homogénat tissulaire) à l'aide d'anticorps dirigés contre ces protéines que l'on souhaite détecter. Le western blot permet ainsi de visualiser des protéines particulières dans un mélange complexe. C'est l'une des techniques analytiques de transfert sur membrane utilisées en biochimie et en biologie moléculaire.

Les cinq étapes de la technique

1. Extraction et dosage. On lyse les cellules ou le tissu dans un tampon contenant des inhibiteurs de protéases, puis on dose les protéines totales (Bradford, BCA) pour déposer la même quantité dans chaque puits. Sans ce dosage, la comparaison entre pistes n'a aucun sens.
2. Séparation par SDS-PAGE. L'échantillon est dénaturé par chauffage en présence de SDS et d'un réducteur (β-mercaptoéthanol ou DTT). Le SDS, détergent anionique, se fixe le long de la chaîne polypeptidique et lui donne une charge négative proportionnelle à sa masse : toutes les protéines migrent alors vers l'anode, et le gel de polyacrylamide les sépare uniquement selon leur masse moléculaire. Un marqueur de taille est déposé en parallèle.
3. Transfert. Les protéines sont transférées du gel vers une membrane de nitrocellulose ou de PVDF, sous champ électrique (transfert liquide ou semi-sec). Le profil de migration est ainsi recopié sur un support accessible aux anticorps.
4. Saturation et immunodétection. On sature les sites libres de la membrane (lait écrémé ou BSA) pour éviter les fixations non spécifiques, puis on incube avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine cible, on lave, puis on incube avec un anticorps secondaire couplé à une enzyme (le plus souvent la peroxydase de raifort, HRP).
5. Révélation. L'ajout du substrat produit un signal, en général une chimiluminescence, capté sur film ou par un imageur. On obtient une bande à la hauteur correspondant à la masse attendue de la protéine.

Lire et interpréter un western blot

Trois réflexes. Vérifier que la bande est à la bonne taille par rapport au marqueur : une bande au mauvais poids moléculaire est probablement non spécifique. Vérifier le contrôle de charge — une protéine constitutive comme l'actine, la GAPDH ou la tubuline — qui prouve que la même quantité a bien été déposée dans chaque piste. Et se rappeler que le western blot est semi-quantitatif : on compare des intensités relatives entre pistes d'une même membrane, on n'obtient pas une concentration absolue.

Les problèmes classiques en TP : bandes déformées ou « souriantes » (migration trop rapide ou gel mal polymérisé), fond noir généralisé (saturation insuffisante ou anticorps trop concentré), absence totale de signal (transfert raté — d'où l'intérêt de vérifier au rouge Ponceau juste après le transfert).

À ne pas confondre

Le nom vient d'un jeu de mots : le Southern blot, du nom d'Edwin Southern, détecte l'ADN ; par analogie, le Northern blot détecte l'ARN et le Western blot les protéines. Pour doser une protéine de façon quantitative, on utilisera plutôt un ELISA.

Cette technique est au programme des travaux pratiques de biochimie structurale, de biologie moléculaire et d'immunologie — et elle revient très souvent dans les questions de soutenance de PFE.